Bioquímica · Tema
Espectrofotometría y colorimetría (ley de Beer–Lambert) !
Una solución coloreada absorbe luz en proporción a la cantidad de sustancia que contiene. Medir esa luz absorbida da la concentración.
Actualizado 2026-11-01
Datos clave
- Ley de Beer–Lambert: absorbancia A = ε × c × l (absortividad molar × concentración × longitud del paso de luz); con longitud fija, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración.
- Absorbancia A = log (I₀/I) = −log T; la transmitancia (T) cae de forma exponencial al subir la concentración, por eso el laboratorio lee absorbancia y no transmitancia.
- Colorímetro: usa filtros para la luz visible y un producto coloreado de reacción. Espectrofotómetro: usa un monocromador para una longitud de onda precisa, incluido el ultravioleta.
- El NADH absorbe a 340 nm y el NAD⁺ no: la mayoría de las pruebas enzimáticas (LDH, ALT, AST, CK, glucosa por hexocinasa) siguen la subida o bajada de la absorbancia a 340 nm.
- Concentración desconocida = (absorbancia de la muestra ÷ absorbancia del estándar) × concentración del estándar, siempre corregida con un blanco.
En detalle
- 1. Fuente de luz → selector de longitud de onda (filtro o monocromador) → cubeta con la muestra → detector (fotocelda) → lectura.
- 2. El blanco (reactivos sin muestra) lleva la absorbancia a cero para que solo cuente la sustancia medida.
- 3. La longitud de onda elegida es la que más absorbe el producto coloreado (su color complementario): una solución azul se lee en la banda naranja–roja.
- 4. La ley se cumple solo en un rango: las muestras muy concentradas o turbias se desvían y deben diluirse.
- 5. Las proteínas absorben a 280 nm (triptófano y tirosina) y los ácidos nucleicos a 260 nm; la relación 260/280 revisa la pureza del ADN.
- 6. Métodos relacionados: fotometría de llama (emisión de luz del Na⁺ y el K⁺ en una llama; hoy casi reemplazada por electrodos ion-selectivos), fluorometría, turbidimetría y nefelometría (luz dispersada, para inmunoglobulinas y PCR).
- También llamado
- Ley de Beer–Lambert, Absorbancia, Fotometría de llama
Correlación clínica
- La oximetría de pulso aplica el mismo principio: la hemoglobina oxigenada y la desoxigenada absorben distinto la luz roja e infrarroja.
- Los cooxímetros miden varias longitudes de onda para detectar carboxihemoglobina y metahemoglobina, que el oxímetro de pulso común lee mal.
- Muchas pruebas de química de rutina (glucosa, creatinina por reacción de Jaffé, bilirrubina, enzimas) son colorimétricas o espectrofotométricas.
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¿Qué dice la ley de Beer–Lambert?
La absorbancia es igual a absortividad molar × concentración × longitud del paso de luz; con longitud fija, la absorbancia sube en proporción directa a la concentración.
¿Por qué muchas pruebas enzimáticas se leen a 340 nm?
El NADH y el NADPH absorben a 340 nm y el NAD⁺ y el NADP⁺ no, así que el cambio de absorbancia sigue la reacción.
¿Para qué sirve el blanco en una prueba colorimétrica?
Pone el equipo en cero con los reactivos pero sin muestra, para que solo la sustancia medida sume absorbancia.
¿Cuál es la diferencia principal entre un colorímetro y un espectrofotómetro?
El colorímetro selecciona la luz con filtros en el rango visible; el espectrofotómetro usa un monocromador para longitudes de onda exactas, incluido el ultravioleta.
¿Qué formas de hemoglobina lee mal un oxímetro de pulso común de dos longitudes de onda?
La carboxihemoglobina y la metahemoglobina; se necesita un cooxímetro con más longitudes de onda.
Información educativa, no es consejo médico. Ante un síntoma, consulte a un profesional de la salud.
Fuentes: Pulse Oximetry: MedlinePlus Medical Test (MedlinePlus, US National Library of Medicine, 2026); Blood gases: MedlinePlus Medical Encyclopedia (MedlinePlus, US National Library of Medicine, 2026); Textbook of Biochemistry for Medical Students, 6th ed. (Jaypee Brothers Medical Publishers (Vasudevan DM, Sreekumari S, Vaidyanathan K), 2011).
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